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冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過1 小時(shí)， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；

4．如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；

5．如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

小鼠 TIM-3 / HAVCR2 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

食蟹猴 CD53 (aa 107-181) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

小鼠 CREG / CREG1 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

小鼠 Biglycan / PG-S1 / BGN 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

 TMEM25 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

 TSPAN1 (aa 110-211) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

 LFA-3 / CD58 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

食蟹猴 B7-DC / PD-L2 / CD273 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

食蟹猴 CD84 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

食蟹猴 CD83 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

骨骼肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞硝酸 99.99% metals basis壬酸 97%VTG ELISA Kit  鯉魚卵黃蛋白原

硝酸 99.997% metals basis壬酸 98%GnRH ELISA Kit   魚類促性腺釋放

高氯酸 CP,70.0-72.0%季戊四 AR,98.0%Fish Tri-iodothyronine,T3 ELISA Kit  魚類狀腺原

高氯酸 AR,70.0-72.0%乙二  99.4%Fish Cortisol ELISA Kit  魚類皮質(zhì)

高氯酸 70%, 99.999% metals basis三鈉 97%Fish high sensitivity C-Reactive Protein,hs-CRP ELISA Kit   魚類超敏C反應(yīng)蛋白

高氯酸 GR,70.0-72.0%三 97%Fish Oste ocalcin/Bone gla protein,OT/BGP ELISA kit  魚骨鈣素/骨谷蛋白

高氯酸 ACS, ≥69% (T)阿斯巴甜 98%Cherax quadricarinatus lipovilin/vilin,Lv/Vn ELISA Kit   紅螯光殼螯蝦卵黃脂磷蛋白/卵黃磷蛋白

氯化 ≥99.99% metals basis碳酸鎘 AR,98%Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV ELISA Kit  羅氏沼蝦諾達(dá)病